17-alfa-hidroxipregnenolona é formada pela hidroxilação da pregnenolona. A maior parte da pregnenolona circulante é de origem do córtex adrenal e seus níveis apresentam modesto aumento após a administração de ACTH. Este ensaio é primariamente útil no diagnóstico da hiperplasia adrenal congênita por deficiência da 3 beta-OH-esteróide desidrogenase. É também útil para sugerir a presença de um tumor virilizante adrenal. Níveis moderadamente aumentados são observados na Síndrome de Cushing ACTH-dependente