A maioria do cortisol plasmático está ligada a proteínas e aproximadamente 1% é secretado intacto na urina. O cortisol urinário normalmente é tido como um reflexo do nível de cortisol plasmático não-ligado (livre), que é biologicamente ativo. Em casos de superprodução de cortisol, a globulina de ligação do cortisol torna-se saturada, tanto que o cortisol plasmático não-ligado aumenta desproporcionalmente, assim como a secreção urinária. A medição de cortisol urinário é um meio sensível de determinação da hiperfunção adrenocortical, como a síndrome de Cushing. O cortisol urinário de coleta de 24 horas representa a integração após um dia inteiro e não é afetado pela variação diurna evidente em níveis de cortisol plasmático